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原文传递一种时间分辨荧光定量检测25羟基维生素D的试剂盒及方法

专利名称：	一种时间分辨荧光定量检测25羟基维生素D的试剂盒及方法
摘要：	本发明涉及一种利用时间分辨荧光免疫层析技术的灵敏性，利用稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，结合干式免疫荧光分析仪实现高灵敏度、可准确定量、简便快捷的25羟基维生素D时间分辨荧光免疫层析试剂盒及检测方法。本发明试剂盒能够准确定量检测人血清、血浆和全血样本中25羟基维生素D的含量，通过滤血膜样品垫的处理可过滤全血样本，利用时间分辨检测技术，可避免样本本身荧光干扰，荧光微球为稀土钒酸盐纳米材料具有背景低，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将稀土钒酸盐纳米颗粒与抗体连接，标记产物稳定，具有检测范围宽(3～100ng/mL)、灵敏度高(检出限3ng/mL)、准确度高、检测快速简便等特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	厦门稀土材料研究所
发明人：	张云;张肖;宋良
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910357266.4
公开号：	CN109975559A
代理机构：	杭州千克知识产权代理有限公司
代理人：	冷红梅
分类号：	G01N33/82(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	361021 福建省厦门市集美区兑山西珩路258号
主权项：	1.一种时间分辨荧光定量检测25羟基维生素D的试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡、样本解离液和含有定标曲线的ID卡，其特征在于：所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述检测试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述滤血膜样品垫、玻璃纤维结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述滤血膜样品垫处喷涂有样品垫处理液；所述结合垫设置有微球线，喷涂有时间分辨荧光微球标记的25羟基维生素D单克隆抗体，所述时间分辨荧光微球为稀土钒酸盐纳米颗粒，粒径为150±50nm，其组成为LnVO4:xEu，其中，LnVO4为基质，Ln为镧、钇、钆、钐、铽中的一种或多种；冒号“：”表示为铕掺杂；x为Eu的摩尔百分数，范围是5％～50％；25羟基维生素D单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线，检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中检测线靠近加样孔，质控线远离加样孔；所述检测线包被有25羟基维生素D重组抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；25羟基维生素D重组抗原包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜；所述样本解离液为含20mM乙酸钠，1％氯化胆碱，1％Tween-20的50mM、pH8.0 Tris-HCl缓冲液。 2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测试纸条由如下方法制备： (1)稀土钒酸盐纳米荧光微球的制备方法在50mL圆底烧瓶中，按摩尔比例，加入2份蒸馏水，(1-x)份Ln的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x份Eu的硝酸盐或醋酸盐或氯化物，x为摩尔百分数，范围是5％～50％，1份原钒酸，(1～5份)柠檬酸或柠檬酸钠，用氢氧化钠调节pH值6～8，通入氮气，85℃反应24小时，10000rpm离心，用蒸馏水洗涤3次，干燥得到分散性好的水溶性LnVO4:x Eu纳米荧光探针； (2)时间分辨荧光微球的活化超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml； (3)时间分辨荧光微球标记25羟基维生素D单克隆抗体的制备在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照50～200μg/200μl加入25羟基维生素D单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5 Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20的10～50mM、pH7.5～8.5 Tris-HCl保存液洗涤并重悬至200μl于4℃避光保存； (4)样品垫的制备用样品垫处理液在滤血膜上平行均匀喷涂两条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫，所述样品垫处理液为含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl； (5)结合垫的制备在结合垫上将时间分辨荧光微球标记的25羟基维生素D单克隆抗体用微球解离液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫。置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述样品垫处理液为含0.5％NaCl、0.5％Tween-20、0.1％BSA的20mM、pH8.0的Tris-HCl；所述微球稀释液为含0.5％BSA、30％蔗糖的20mM Tris-Hcl缓冲液； (6)包被膜的制备分别用包被缓冲液将25羟基维生素D重组抗原和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线和检测线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜； (7)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。 3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述时间分辨荧光试纸卡由检测试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。 4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述含有标准曲线的ID卡，是通过时间分辨荧光试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中获得。 5.利用权利要求1所述试剂盒的定量检测25羟基维生素D的方法，所述方法包括： (1)将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用； (2)开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应ID卡； (3)精确吸取20μL待测血液加入样本解离液中，混匀； (4)吸取混合后样本80μL，加入到检测卡加样孔中； (5)将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。
所属类别：	发明专利