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原文传递一种利用磁性表面增强拉曼免疫基底的检测方法

专利名称：	一种利用磁性表面增强拉曼免疫基底的检测方法
摘要：	本发明公开了一种利用磁性表面增强拉曼免疫基底的检测方法，属于功能材料技术领域。本发明以磁性聚磷腈微球基材（MPCTP），采用种子介导法，在MPCTP微球表面均匀包覆金壳，制得MPCTP@Au表面增强拉曼活性基底微球。对MPCTP@Au SERS标记和抗体耦合，得到磁性SERS免疫基底。该基底具有很强SERS活性，可用于小分子SRES检测分析。同时该基底对免疫蛋白具有高灵敏的多重检测性能。本发明制备方法简单，回收方便，产品具有广阔的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福州大学
发明人：	游力军;黄慈;许珂;丁冠军;张其清
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-19T00:00:00+0800
申请号：	CN201910391964.6
公开号：	CN110031447A
代理机构：	福州元创专利商标代理有限公司
代理人：	修斯文;蔡学俊
分类号：	G01N21/65(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	350108 福建省福州市闽侯县上街镇福州大学城学院路2号福州大学新区
主权项：	1.一种利用磁性表面增强拉曼免疫检测基底的检测方法，其特征在于：包括如下具体步骤：（1）制备磁性SERS免疫基底；（2）将HAuCl4与柠檬酸钠反应，得到Au纳米粒子；将Au纳米粒子与拉曼标签分子反应，得到SERS标记的Au纳米粒子；所用拉曼标签分子为DTNB、4-MBA和4-CBT中的一种或几种；（3）将步骤（2）得到的SERS标记Au纳米粒子与抗体IgG耦合，得到SERS免疫探针；所用抗体为鼠抗人IgG、羊抗兔IgG和鼠抗羊IgG中的一种或几种。（4）对待测抗体进行免疫检测应用：取步骤（1）得到的磁性SERS免疫基底和步骤（3）得到的SERS 免疫探针混合，然后加入待检测的抗体IgG，进行免疫反应，反应后的样品进行SERS免疫检测鉴定；其中所述的IgG为羊IgG、兔 IgG 和人IgG中的一种或几种。 2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磁性SERS免疫基底的制备方法包括以下步骤：（1）将磁性聚磷腈微球MPCTP分散于聚乙烯亚胺PEI溶液中，超声反应30min，得到MPCTP-PEI微球；将MPCTP-PEI微球与金溶胶按固液比1 mg:1 mL～1 mg:5 mL超声反应 1h，得产物记为MPCTPAS种子微球；（2）采用种子介导法，取步骤（1）制备的MPCTPAS分散在K-Gold溶液中，加入还原剂，超声反应后得到表面增强拉曼活性基底，记为MPCTP@Au；（3）将步骤（2）得到的MPCTP@Au与抗体IgG耦合，得到的磁性SERS免疫基底，所用抗体为羊抗人IgG、驴抗兔IgG和兔抗羊IgG中的一种或几种。 3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中磁性聚磷腈微球的制备过程如下：称取10～100 mg四氧化三铁粉末分散于150mL乙腈中，超声分散30min后，依次加入30～100 mg六氯三聚磷腈、22～73mg间苯三酚和1～4mL三乙胺，然后加热至20～60℃，超声回流反应0.5～6h后，产物磁分离，用乙腈、乙醇和超纯水反复洗涤，最后真空干燥24h，得到磁性聚磷腈微球。 4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）的操作过程如下： MPCTP-PEI微球与金溶胶按固液比1 mg:1 mL～1 mg:5mL的比例混合，20～30℃超声0.5～2h，用超纯水反复离心并磁力富集分离，得到MPCTPAS种子微球。 5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）K-gold溶液制备方法为：量取30～135mL超纯水，依次加入7.5～30mg碳酸钾和0.45～1.8mL浓度为25mmol/L的氯金酸溶液，磁力搅拌30min，静置避光陈化12～24h，制得K-gold溶液。 6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）具体为：称取1～5mg MPCTPAS微球、30～120μL 还原剂和30～135mL K-gold溶液，室温搅拌40～160min，反应结束后用超纯水反复洗涤，磁力分离得到产物；所述还原剂为抗坏血酸、柠檬酸钠、甲醛、硼氢化钠中的一种或几种。 7.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）具体为：取0.1 mg～50 mg步骤（2）得到的MPCTP@Au，分散在0.5-50 mL BBS缓冲液，然后加入10～200 μL 1mg/L的抗体IgG，并在4℃下孵育12小时。随后，在上述混合物中加入10-200 μL 5%牛血清白蛋白，室温下振荡孵育1小时；最后磁分离产物，并用BBS缓冲液冲洗三次，最终得到SERS免疫基底。 8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）具体为：取0.1 mL～50 mL步骤（2）得到的SERS标记的Au纳米探针，然后加入0.1～500 μL 1mg/L的抗体IgG，并在4℃下孵育12小时；随后，在上述混合物中加入10-200 μL 5%牛血清白蛋白BSA，室温下振荡孵育1小时；最后产物离心分离，并用BBS缓冲液冲洗三次，最终得到SERS免疫探针。 9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（4）具体为：取5~300 μL 步骤（3）的SERS免疫探针加入离心管，与2~200μL 步骤（1）SERS免疫基底，随后加入5~200 μL的待测IgG；在室温下振荡孵育1~4小时后，用磁铁分离产物并用BBS缓冲液洗涤三次；最后，将产物分散在20 μL水中，取10 μL分散液滴在干净的载玻片上，氮气吹干后，利用激光显微共聚焦拉曼光谱仪对其进行SERS免疫检测。
所属类别：	发明专利