详情

原文传递一种贝伐珠单抗的临床前药代动力学研究质谱分析方法

专利名称：	一种贝伐珠单抗的临床前药代动力学研究质谱分析方法
摘要：	本发明的一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，属于蛋白质组学的技术领域。采取的技术方案是，选取经胰酶水解Bevacizumab获得的特异性肽段，其中特异性是指肽段只由Bevacizumab经胰酶水解产生，其他蛋白质及蛋白质类药物经胰酶水解并不能产生该肽段；基于液相色谱‑串联质谱技术，利用平行反应监测模式对特异性肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。本发明具有高通量、灵敏度高、重现性好等特点；所用试剂及药品更廉价易得，配制方法简单，利于方法推广；样品处理过程和定量方法简单易行，对其他蛋白类药物和多肽药物的定性和定量研究具有指导借鉴意义。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京智谱分子医学技术研究院有限公司
发明人：	胡良海;李潇影;张海洋;陶纬国
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910229218.7
公开号：	CN110045028A
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	210000 江苏省南京市江北新区浦东北路7号扬子科创总部基地一期A区4号楼1132室
主权项：	1.一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，所述的单克隆抗体药物为贝伐珠单抗；按如下7步骤进行血浆样品中单抗浓度的测定；（1）血浆样品的还原：于聚乙烯管中加入2 mL大鼠的血浆样品，加入96 mL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2 mL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1小时，得到反应液；（2）半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75 mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃避光孵育40 min；（3）血浆样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700 mL消化缓冲液，涡流混合，再加入3 mL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12~16 h得到血浆样品酶解液，加入5 mL甲酸终止反应；（4）内标的引入：于酶解液中加入10 mL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到血浆样品的反应液；（5）血浆反应液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1 mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1 mL淋洗溶液，至液体自然流完；取血浆样品的反应液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1 mL淋洗溶液，至液体自然流完，3遍洗；于固相萃取柱中加入1 mL洗脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；（6）血浆样品的浓缩复溶：将血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入100 mL 0.1%甲酸，涡流混匀，得到血浆样品的复溶液；（7）血浆样品的质谱分析：取血浆样品复溶液2 mL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将所选的特异性肽段峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线y=0.000239987+0.0684449x，其中，x为特异性肽段峰面积与内标峰面积比值，y为以ng/mL为单位的单抗浓度，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应血浆样品中贝伐珠单抗浓度。 2.根据权利要求1所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的标准曲线y=0.000239987+0.0684449x，建立过程有标准系列溶液的配置和大鼠血浆标准曲线样品的制备；所述的单抗标准系列溶液的配置，是利用去离子水将单抗标准溶液储备液（25 mg/mL）分别稀释至5、10、40、100、500、1000、1200 ng/mL；所述的大鼠血浆标准曲线样品的制备，有如下7步骤，（1）大鼠血浆标准曲线样品的还原：于聚乙烯管中分别加入2 mL上述步骤中的单抗标准系列溶液；加入2 mL大鼠的空白血浆，涡流混匀；加入94 mL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2 mL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1 h，得到反应液；（2）半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75 mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃孵育避光40 min；（3）大鼠血浆标准曲线样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700 mL消化缓冲液，涡流混合，再加入3 mL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12~16 h得到单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液，后加入5 mL甲酸终止反应；（4）内标的引入：于单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液中加入10 mL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液；（5）单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1 mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1 mL淋洗溶液，至液体自然流完；取步骤（4）得到的单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液加入到固相萃取柱中，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1 mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入1 mL洗脱溶液，至液体自然流完，得单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液，置于聚乙烯管中；（6）单抗大鼠血浆标准曲线样品的浓缩、复溶：将单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液真空离心蒸干，加入100 mL 0.1%甲酸，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液；（7）单抗大鼠血浆标准曲线样品的质谱分析：取2 mL单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以初始单抗标准系列溶液中单抗浓度为横坐标，所选的酶解后特异性肽段峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=1/x2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。 3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的含有变性剂的pH缓冲液，是含有8 M尿素的50 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；所述的还原剂，是1M的二硫苏糖醇溶液；所述的半胱氨酸封闭剂，是固体碘乙酰胺试剂；所述的消化缓冲液，是50 mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液；所述的胰酶溶液，是1mg/mL的胰酶水溶液；所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液。 4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的液相色谱-串联质谱分析，色谱条件为：美国赛默飞世尔公司Ultimate 3000系列高效液相色谱系统；色谱柱：自制peptide C18毛细管色谱柱，15 cm×75 µm I.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱；流速300nL/min；进样量2mL；质谱条件为：Q-Exactive Orbitrap四级杆-轨道阱液相色谱-串联质谱仪，配有纳升级电喷雾离子化源和Xcalibur 2.1数据处理软件；离子源：纳升级电喷雾离子化源；正离子方式检测；扫描方式为平行反应监测；全扫分辨率为70000，目标扫描分辨率为35000，最大注入时间为200 ms。 5.根据权利要求4所述的单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，其特征是，所述的梯度洗脱，过程见表1，表1 梯度洗脱程序其中A是甲酸体积百分数占0.1%的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1%的乙腈溶液。
所属类别：	发明专利